单细胞实战(三) Cell Ranger使用初探
实战演练
理论知识学再好，能付诸实践灵活运用才行，所以我们常强调知行合一，实践出真知。实战演练这个栏目就是带大家从头到尾完整复现单细胞文献分析流程。好了，干货多，屁话少，我们来看实战流程。
希望大家能有所收获！
mkdir -p $wkd/qc
cd $wkd/qc
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R1*.gz'>P2586-4-id-1.txt
find $wkd/raw/P2586-4 -name '*R2*.gz'>P2586-4-id-2.txt
cat P2586-4-id-1.txt P2586-4-id-2.txt >P2586-4-id-all.txt
cat P2586-4-id-all.txt| xargs fastqc -t 20 -o ./
然后利用Filezilla下载其中SRR7722937的R1、R2的html，打开看下
首先是R1的，这个就是16bp Barcode+10bp UMI，可以看到Phred值是比较稳定的
然后看下真实的测序数据：它的Phred值开始质量较差，中间较好，测序结束位置质量有下降，这是和测序仪的工作原理有关的
测序仪在刚开始进行合成反应的时候也会由于反应还不够稳定，会带来质量值的波动；碱基的合成利用的的是聚合酶化学反应，使得碱基可以从5’端向3’端合成并延伸。但合成的过程中随着链的增长，DNA聚合酶的效率会不断下降，特异性也开始变差，越到后面碱基合成的错误率就会越高）
总体上还是在Q30以上的，数据质量不错，并且没有接头序列
如果要对Fastqc结果进行详细的了解，可以去官网的帮助信息，非常的简明扼要：<https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/
什么是Cell Ranger？
官网的说明最原汁原味：Cell Ranger is a set of analysis pipelines that process Chromium single cell 3’ RNA-seq output to align reads, generate gene-cell matrices and perform clustering and gene expression analysis.
到目前为止，它有1.0，1.1，1.2，1.3，2.0，2.1，2.2，3.0这8个版本，其中1.2版本之后的可以支持Chromium Single Cell 3' v1 and v2 试剂，最新的V3试剂需要用到3.0版本
要分析的文章中使用了两个不同的版本（2.0和2.1）去分析两个患者的数据：
那么这个软件能干什么事？
它主要包括四个主要基因表达分析流程：
cellranger mkfastq ： 它借鉴了Illumina的
bcl2fastq，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件cellranger count ：利用
mkfastq生成的fq文件，进行比对(基于STAR)、过滤、UMI计数。利用细胞的barcode生成gene-barcode矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析cellranger aggr ：接受
cellranger count的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如tumor组原来有4个样本，PBMC组有两个样本，现在可以使用aggr生成最后的tumor和PBMC两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响cellranger reanalyze ：接受
cellranger count或cellranger aggr生成的gene-barcode矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类
它的结果主要是包含有细胞信息的BAM, MEX, CSV, HDF5 and HTML文件
相关的术语
Sample：（样本）从单一来源(比如血液、组织等)提取的细胞悬液
Library：（文库）单个样本制备的10X barcode 测序文库，对应10X Chromium Controller一个run（即运行一次）的单个芯片通道
Sequencing Run / Flowcell: 测序仪主要依靠flowcell（例如Hiseq4000就有2个flowcell），每运行一次就是run一次，数据会在flowcell上产出，然后这些数据又会根据flowcell上的不同lane以及lane上不同样本的index进行区分
以上术语的错综复杂：
单独一个样本可以制备成多个文库，这样可以一次run就得到更多的细胞数量，而不用在单次run的单个文库中使用全部的样品，造成"过载"现象("过犹不及")
单独一个样本可以跨多个flowcell测序，如果它们是在一次测序过程中产出，就可以将产出的reads合并
上面说一个文库可以用多个flowcell，那么一个flowcell也可以包含多个文库，使用不同的lane上或者样本的index进行区分
同一个10x 芯片的两个channels可以说是两个文库，但是两个不同芯片的同一个channel不能说是两个文库
大体流程
主要根据sample、library、flowcell的数量来定义分析的复杂程度(由浅入深)
一个sample、一个library、一个flowcell
这是最基本的模式：只有一个生物样本，只需要制备一个文库，在一个flowcell上测序就好，通过
mkfastq得到fastq文件后直接运行count就好(具体见： Single-Library Analysis)一个library，多个flowcell
如果有个文库在多个flowcell上测序，可以利用 Running Multi-Library Samples 将不同测序run的reads混合
一个sample，多个library
如果一个样本有多个文库(比如做了技术重复)，那么每一个文库的数据应该单独跑
cellranger count流程，然后可以利用aggr整合起来， Multi-Library Aggregation ；当然先将一个样本的多个文库组合在一起再分析也是可以的，就需要利用到 MRO syntax (这里先做了解)多个samples
必须每个样本的每个文库单独跑
cellranger count，比如说：实验中有4个样本，每个样本由两个文库(或者两个技术重复)，那么就需要跑count流程8次，最后利用aggr汇总在一起
系统要求
Linux 至少8核CPU(推荐16核)
64GB RAM(推荐128GB)，最低配的64G允许
cellranger aggr合并最多250k个细胞1T硬盘
64-bit CentOS/RedHat 6.0 or Ubuntu 12.04
软件依赖
大多软件是和Cell Ranger打包在一起的，但是cellranger mkfastq 依然需要Illumina bcl2fastq (要求版本2.17以上；如果使用Novaseq，最好用版本2.20或者更高)
使用资源限制
Cell Ranger默认在本地运行(或者使用--jobmode=local指定)，它会占用90%的空余内存以及所有空余的CPU。如果要进行资源限制，可以使用—localmem或者--localcores
下载软件
为了复现文章，我们需要用到Cell Ranger 2.0与2.1，其中2.0版本是2017年9月发布的，2.1版本是2018年2月发布的
# 2.0版本下载(732M)curl -o cellranger-2.0.2.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.0.2.tar.gz?Expires=1557256518&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMC4yLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI1NjUxOH19fV19&Signature=HoJUuPo4iTFdQgzFU1GH7uKf3uGitQxTjB6WOA9qGPlejf7tNcBPjO65WuSUZ~w8WWdeAvky-oV7XGfheY-bUr2b7QHr7jQEqc84cyU~PLvT~fYjkgC7cG7nlpbJOT~b7U~YH9amvR~SCLlyynp7scPDIA~9~keCYrIPgevTf2QyktybuSyjNTwugefOic~~XFkc9lrS~WQ9MNA1CLl4ExlQKsxWS77PEB6mwrMZXX65obDnZW9fIs3dIny6H5YoadbkgmsT52jmLien6PsG1g2jpAO90pPuHoru8LL64Q9gmB3I0nJAqi3EmrO3GKnUpHUhGb6doKmjSN6XccpmsA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
# 2.1版本下载
curl -o cellranger-2.1.1.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-2.1.1.tar.gz?Expires=1557260110&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTIuMS4xLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU1NzI2MDExMH19fV19&Signature=RNQd-gTASTQhtnUSBfQWrnqo6Pyy2wDXtV5tlxkG97727GvoRhMqFXbEsz4gJl2BMckdVvW3S1tZRwRo5pmxPzmhq-8RKxf99pGqlzo84HYqhbIRkxXlIbLbj-u3PUJqo8cesWpbSVSKkS2TCNS-9GMFNieQswqMS2-DN4BqoBOJnWr7T4wlOMd9hypXWwOsW2P2fqaM-WP2ooMyo-oIxm3y9gDghXdDEP5lvHU7GCQcFGGexkdIrD6S5p8JPJ1DB5XieGrtEuP1YVp6tLMGXFoRWXS8dQLI1egWDYlOuRaiQgLIb3o5ZxBg5NpzLPP5kDHMAVzJFdBpf~~rkyNYTA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
软件下载完，需要解压缩一段时间，因为它打包了太多的软件和资源
tar zxvf cellranger-2.0.2.tar.gz然后添加环境变量(注意：如果之前安装过其他版本，比如我之前装过3.0，但是当前你只想用这个2.0版本，那么就需要在~/.bashrc中将新安装的2.0版本路径放在3.0的下方，因为linux是根据$PATH自上而下调用软件的，将新安装的路径放在.bashrc下方，那么在$PATH中显示的就是新路径在上方，它们的顺序是相反的)
# 原来我的~/.bashrc中有个cell ranger 3.0
export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.2.0:$PATH
# 现在我想输入cellranger时先调用2.0版本，那就在3.0的下方写上
export PATH=/home/biosoft/cellranger-3.0:$PATH
export PATH=/home/biosoft/cellranger-2.0.2:$PATH
# 然后保存退出，激活环境变量
# 这时查看环境变量
echo $PATH
/home/biosoft/cellranger-2.0.2:/home/biosoft/cellranger-3.0
# 于是输入cellranger，给出的帮助文档就是
cellranger (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc. All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------
Usage:
cellranger mkfastq
cellranger count
cellranger aggr
cellranger reanalyze
cellranger mkloupe
cellranger mat2csv
cellranger mkgtf
cellranger mkref
cellranger vdj
cellranger mkvdjref
cellranger testrun
cellranger upload
cellranger sitecheck
# 成功切换了版本！
然后安装好以后，cellranger还提供了一个小工具(我认为是个有意思的地方)，让你全面了解你的linux性能，不用自己找代码。另外这些代码我们也可以借鉴，以后再用
$ cellranger sitecheck > sitecheck.txt为了确保软件所有的自带流程都成功安装，可以进行一个软件自检
cellranger testrun --id=tiny
# 我使用了12个CPU，大约需要20分钟检查完
# 如果成功完整地安装的话，最后会给出这样一个报告：
cellranger testrun (2.0.2)
Copyright (c) 2017 10x Genomics, Inc. All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------
Running Cell Ranger in test mode...
Martian Runtime - 2.0.2-2.2.2
Running preflight checks (please wait)...
[runtime] (ready) ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
[runtime] (split_complete) ID.tiny.SC_RNA_COUNTER_CS.SC_RNA_COUNTER.SETUP_CHUNKS
...
Pipestance completed successfully!
参考序列下载(1.2.0版本，2016年12月发布)
文章比对到了hg38(基于ensembl数据库)，不能直接使用网站下载的基因组与注释文件，需要过滤一下
如果直接下载的话一共11GB，当然这里面包含了基因组、注释源文件，以及cell ranger自己利用mkgtf构建的注释和mkref构建的基因组
# 然后解压
tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0.tar.gz
如果要自己尝试构建，可以使用
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
# 下载注释
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz
# 软件构建注释
# mkgtf <input_gtf> <output_gtf> [--attribute=KEY:VALUE...]
cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf \
--attribute=gene_biotype:protein_coding \
--attribute=gene_biotype:lincRNA \
--attribute=gene_biotype:antisense \
--attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_C_gene
# 我看到这里写了这么多gene_biotype（也就是基因的生物类型）的键值对，不禁好奇，GTF中存在多少种基因类型？
$ cat Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf |grep -v "#" |awk -v FS='gene_biotype ' 'NF>1{print $2}'|awk -F ";" '{print $1}'|sort | uniq -c
213 "IG_C_gene"
33 "IG_C_pseudogene"
152 "IG_D_gene"
76 "IG_J_gene"
9 "IG_J_pseudogene"
1209 "IG_V_gene"
646 "IG_V_pseudogene"
125 "TR_C_gene"
16 "TR_D_gene"
316 "TR_J_gene"
12 "TR_J_pseudogene"
848 "TR_V_gene"
110 "TR_V_pseudogene"
45662 "antisense"
58181 "lincRNA"
2337766 "protein_coding"
# 软件利用构建好的注释，去构建需要的基因组
cellranger mkref --genome=GRCh38 \
--fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
--genes=Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf \
--ref-version=1.2.0
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